前言

       癲癇是發(fā)病率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，全世界有超過5000萬人患有癲癇。發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率約為每年40-70/10萬人。在目前的治療中，大約2/3的癲癇患者沒有發(fā)生癲癇發(fā)作，但是對于另外的1/3癲癇患者，盡管已有數(shù)種抗癲癇藥物(AEDs)可供使用，但仍然沒有得到很好的控制。因此在癲癇治療領(lǐng)域始終也我們在一直期盼著更加有效的新藥的出現(xiàn)。

       左乙拉西坦(Levetiracetam，簡稱LEV)是繼續(xù)卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉等傳統(tǒng)抗癲癇藥物之后的由比利時UCB公司開發(fā)的第二代新型抗癲癇藥物(商品名Keppra?)。1999年12月正式批準(zhǔn)用于16歲以上成人部分發(fā)作的輔助治療，2005年6月又將適應(yīng)癥擴(kuò)大到4歲以上兒童。左乙拉西坦憑借其獨(dú)特的作用機(jī)制，對于成人癲癇部分發(fā)作治療效果獲得了肯定，且耐受性良好。

       2016年1月14日和2016年2月18日歐洲醫(yī)藥管理局(EMA)和美國食品藥品管理局(FDA)分別于批準(zhǔn)了比利時UCB公司開發(fā)的第三代抗癲癇藥物—布瓦西坦(Brivaracetam，簡稱BRV)，商品名為Briviact?。用于治療16歲及以上部分發(fā)作型的癲癇患者，輔助治療伴隨或不伴隨繼發(fā)全身性發(fā)作。

       BRV和LEV的結(jié)構(gòu)非常相似，都屬于吡咯烷酮衍生物。BRV與LEV的化學(xué)結(jié)構(gòu)相比，僅僅是在吡咯烷烴的4位上連接了一個正丙基。兩個藥物就像雙子座一樣相似，以至于第一次見到BRV時，誤為這是一個偽創(chuàng)新產(chǎn)品，或者UCB公司為了延續(xù)LEV產(chǎn)品所來帶的市場輝煌所做的延續(xù)性產(chǎn)品，且不論判斷的正誤或者研發(fā)的動機(jī)，BRV的發(fā)現(xiàn)背后還是存在著深入的藥理機(jī)制研究，本文也正是想透過BRV的非臨開發(fā)歷程和與LEV的對比優(yōu)勢來透視此類新型抗癲癇藥物獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)。

       SV2A蛋白靶點的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知對于新型抗癲癇藥物開發(fā)的意義

       LEV已經(jīng)上市數(shù)十年，但事實上LEV對于常用的篩選新化合物的經(jīng)典動物模型沒有作用，這與其臨床有效性相矛盾。因此LEV的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起了對當(dāng)時開發(fā)研究方法的一些懷疑，并且增加了在這個研究領(lǐng)域的爭論。

       在BRV開發(fā)之前，作為LEV和BRV靶點的SV2A蛋白的作用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被完全理解。然而，BRV的開發(fā)證明了SV2A蛋白結(jié)合親和力與抗癲癇作用之間的相關(guān)性，并且提高了此類抗癲癇藥物成功開發(fā)的可能性。SV2A蛋白的鑒定和隨后的臨床前癲癇研究方法是影響該領(lǐng)域進(jìn)展的一個里程碑，具有相當(dāng)重大的意義。BRV的有效性也進(jìn)一步強(qiáng)化了對這一觀點和對新方法的需求。

       SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)和BRV的后續(xù)開發(fā)進(jìn)一步證實了這樣一種印象：在過去的20年中，新的AEDs沒有一個能夠提高癲癇治愈患者的比例，是因為目前的藥物開發(fā)所采用的相同動物模型幾乎都是基于相同的假設(shè)和理論基礎(chǔ)。因此，為了探索新的目標(biāo)藥物，迫切需要新創(chuàng)新的癲癇臨床前開發(fā)模型。

       1. SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)叩開了新型癲癇藥物開發(fā)的大門

       SV2蛋白是存在于神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞突觸囊泡中的原型蛋白質(zhì)，具有12-跨膜結(jié)構(gòu)，并由三種亞型SV2A、SV2B和SV2C組成。在SV2亞型中，SV2A在包括大腦皮層、海馬和小腦在內(nèi)的所有腦區(qū)域高度表達(dá)，但是也由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)肌肉接頭表達(dá)，已有研究結(jié)果表明SV2A可以調(diào)節(jié)突觸小泡的胞吐作用和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

       BRV的發(fā)現(xiàn)和非臨床開發(fā)與SV2A蛋白的發(fā)現(xiàn)有著緊密的聯(lián)系，也與第一種顯示與SV2A蛋白結(jié)合的AED藥物L(fēng)EV的發(fā)現(xiàn)有緊密的聯(lián)系。在非臨床研究中，LEV在癲癇發(fā)作模型中顯示出對聽源性和點燃性癲癇發(fā)作、6-Hz電休克和棘波放電具有保護(hù)作用。但在用于AED發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)動物模型——電休克(MES)和戊四氮(PTZ)的模型中顯示出無效。LEV的非臨床特征與臨床研究顯示的廣譜有效性雖然相關(guān)，但其非典型抗癲癇特性表明LEV具有與傳統(tǒng)AED不同的作用機(jī)制。相關(guān)研究隨后揭示了LEV與SV2A蛋白的可逆的，飽和的和立體選擇性的結(jié)合，導(dǎo)致突觸小泡的胞吐減少和興奮性突觸中癲癇活動期間誘發(fā)率降低的增加。從那時起，研究集中在發(fā)現(xiàn)靶向SV2A蛋白的新藥物上，最終導(dǎo)致BRV的開發(fā)。

       2. SV2A蛋白是抗癲癇藥物的潛在好靶點

       一些動物研究表明，SV2A蛋白是控制癲癇發(fā)作的一個潛在好靶點。

       SV2A敲除小鼠不能生長和產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作，會在出生后2-3周內(nèi)死亡。而雜合性SV2A敲除小鼠不顯示自發(fā)性癲癇發(fā)作，而顯示預(yù)癲癇特征，例如增強(qiáng)了對毛果蕓香堿和卡因酸(Kainate)預(yù)驚厥作用的敏感性，減少6-Hz癲癇發(fā)作的閾值和角膜點燃的增加率。對來自SV2A敲除小鼠的培養(yǎng)的神經(jīng)元的研究表明由于較低的初始囊泡釋放概率和刺激期間神經(jīng)遞質(zhì)釋放的減少，突觸后反應(yīng)降低。

       在癲癇發(fā)作的動物模型和從癲癇患者獲得的腦組織中發(fā)現(xiàn)了SV2A蛋白表達(dá)和功能改變，這表明SV2A蛋白表達(dá)/功能的降低促成了癲癇的進(jìn)展。

       SV2A蛋白的結(jié)合與不同癲癇發(fā)作的非臨床模型(如聽覺癲癇發(fā)作小鼠)中的抗癲癇作用緊密相關(guān)，并且SV2A蛋白水平的下降似乎還涉及耐藥性癲癇的機(jī)制。

       所有這些證據(jù)一起表明，SV2A蛋白明確涉及癲癇的發(fā)病機(jī)制，因此可以在其治療中發(fā)揮作用。然而，SV2A的詳細(xì)功能和機(jī)制(例如神經(jīng)遞質(zhì)特異性)仍不清楚。

       BRV的發(fā)現(xiàn)歷程

       正如已經(jīng)提到的那樣，SV2A蛋白作為LEV主要分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)以及隨后對于癲癇治療潛在作用的證據(jù)促成了SV2A機(jī)制新藥的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化程序。

       新的目標(biāo)是確定比LEV能更完全抑制癲癇發(fā)作的高選擇性和更有效的SV2A配體。在體外篩選了約12000種化合物的SV2A結(jié)合親和力，進(jìn)一步篩選了其中的1200種化合物對體內(nèi)驚厥發(fā)作易感小鼠的癲癇發(fā)作保護(hù)作用。最后選擇了約30個化合物，并在不同的癲癇動物模型中進(jìn)行了大量表征。這些研究發(fā)現(xiàn)，LEV吡咯烷環(huán)4位上的取代可以增強(qiáng)結(jié)合親和力。在對這個位點進(jìn)行基團(tuán)替換的系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，與LEV相比，各種小的疏水基團(tuán)具有更強(qiáng)的SV2A親和力。并且在聽覺癲癇發(fā)作試驗中增強(qiáng)了活性。在具有增強(qiáng)結(jié)合親和力的類似物中，最終選擇了分子量為212的與LEV結(jié)構(gòu)相近的2-吡咯烷酮衍生物BRV作為藥物開發(fā)候選物。

       BRV的非臨床特點

       1. BRV具有更高的SV2A蛋白選擇性和結(jié)合力

       BRV是具有SV2A高度選擇性和可逆性的配體，具有優(yōu)于LEV的抑制突觸傳遞和囊泡釋放的親和能力。此外，來自SV2A敲除小鼠的研究結(jié)果顯示，直至600nM(測試的濃度)的濃度，[3H]BRV具有僅標(biāo)記SV2A蛋白的高度選擇性。大鼠和人腦中[3H]BRV的體外結(jié)合顯示，BRV對大鼠和人SV2A顯示出了與LEV類似的親和力(Kd為62nM)；然而對應(yīng)于在癲癇動物模型和人腦切片研究中的突觸前SV2A，BRV對于突觸后SV2A顯示出比LEV高出約15-30倍的親和力。在治療相關(guān)劑量下，BRV占據(jù)大腦中SV2A的80％至>90％。小鼠腦中的離體結(jié)合實驗顯示，BRV在給藥后5-15分鐘內(nèi)達(dá)到SV2A占有率，在該時間范圍內(nèi)也顯示出對癲癇發(fā)作的保護(hù)作用。

       2. BRV具有更快的腦部滲透速度

       BRV具有比LEV (LogD 0.64)更高的親脂性(LogD 1.04)，導(dǎo)致更快的腦部滲透速度，這與癲癇發(fā)作小鼠模型中的快速保護(hù)作用相對應(yīng)。LEV的預(yù)測藥物進(jìn)入半衰期為23分鐘，而BRV僅為3分鐘，在藥物滲透入腦的速度上觀察到約7倍的差異。同樣，在相同聽覺小鼠模型中的離體結(jié)合研究顯示，BRV腹膜內(nèi)(i.p.)給藥后5-15分鐘內(nèi)觀察到SV2A的占有率和活性，而LEV為30-60分鐘。因此，可以更快進(jìn)入大腦的BRV具有較短的作用潛伏期，這對于例如癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)或癲癇集群性發(fā)作的臨床緊急治療情況具有十分重要的意義。

       3. BRV具有更低的有效劑量

       使用高頻神經(jīng)元刺激來比較BRV和LEV的大鼠海馬切片研究表明，BRV增強(qiáng)突觸抑制，并且可以在比LEV低100倍的濃度下來減少突觸傳遞。另外，BRV在減少突觸小泡動員方面比LEV更有效。

       4. BRV具有更高的治療指數(shù)

       BRV雖然顯示出低的治療指數(shù)(在完全點燃發(fā)作動物的旋轉(zhuǎn)桿測試中運(yùn)動損傷的TD50與在相同動物中針對廣義運(yùn)動癲癇發(fā)作保護(hù)的ED50之間的比率)，但仍然比LEV高(148比46)。在杏仁核點燃大鼠的旋轉(zhuǎn)試驗中，BRV具有比LEV更高的治療指數(shù)(4比2)。然而，它明顯高于經(jīng)典的和其他新型抗癲癇藥物(治療指數(shù)從2到21)。

       5. BRV具有更強(qiáng)的抗癲癇潛力和有效性

       體外研究表明，在兩個不同的體外大鼠海馬切片癲癇模型中，BRV具有比LEV更強(qiáng)的抗癲癇潛力和有效性，其劑量范圍與其臨床有效性相關(guān)。與LEV相比，BRV對SV2A親和力的增加與在不同的癲癇體內(nèi)模型中觀察到的對癲癇保護(hù)作用的顯著有效性相關(guān)。BRV的有效性已經(jīng)在包括聽覺小鼠、斯特拉斯堡(GAERS)遺傳失神癲癇大鼠、杏仁核和角膜點燃模型以及缺氧后肌肉細(xì)胞的大鼠模型的部分和全面癲癇發(fā)作模型中進(jìn)行了研究。在這些模型中，BRV始終如一地表現(xiàn)出比LEV更有效和更全面的抑制癲癇發(fā)作。特別是，在杏仁核鼠中，BRV (6.8-210mg/kg)劑量依賴性地降低癲癇發(fā)作嚴(yán)重性，在測試劑量下幾乎完全抑制了癲癇發(fā)作。相比之下，即使在高劑量下，LEV (17-540mg/kg)也僅能提供有限的保護(hù)。在完全杏仁核點燃的大鼠中，BRV還能更全面地抑制運(yùn)動發(fā)作的嚴(yán)重程度和放電后的持續(xù)時間。特別是，BRV對于嚴(yán)重運(yùn)動發(fā)作的抑制劑量為21.2mg/kg，而LEV只有達(dá)到170mg/kg的劑量才能產(chǎn)生類似效果。在測試劑量(212.3mg/kg)下，BRV也顯著降低后續(xù)放電持續(xù)時間，而LEV即使超過1700mg/kg，對此指標(biāo)也沒有任何影響。

       6. SV2A蛋白相互作用的個體差異

       在幾種癲癇動物模型中，BRV與LEV相比所具有的更高有效性也可能是由于與SV2A蛋白相互作用的個體差異。事實上，使用SV2A變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研究表明，BRV與SV2A的相互作用不同于LEV，BRV可能會誘導(dǎo)或穩(wěn)定不同的SV2A蛋白質(zhì)構(gòu)象，這可能提供BRV與LEV相比所不同藥效學(xué)性質(zhì)的分子原理。實際上，LEV和BRV作用于不同的結(jié)合位點或與SV2A蛋白具有不同構(gòu)象狀態(tài)的相互作用。這可能解釋了來自大鼠海馬切片的電生理學(xué)研究的發(fā)現(xiàn)，其顯示BRV具有更大的抑制突觸傳遞和囊泡釋放能力。

       小結(jié)

       BRV已經(jīng)在許多癲癇實驗?zāi)Ｐ椭酗@示出優(yōu)異的抗癲癇活性，并且作為疾病改善作用方面具有一定的前景。臨床前研究表明，與LEV相比，BRV具有更高的有效性，因為其具有更高的選擇性，更高的親和力和不同于SV2A的結(jié)合特性，以及與更快速的腦滲透相關(guān)的親脂性。正是基于這些研究發(fā)現(xiàn)，觸發(fā)了進(jìn)一步臨床開發(fā)BRV的決定。雖然目前尚無臨床研究支持BRV優(yōu)于LEV有效性的證據(jù)，我們也期待著BRV與LEV的頭對頭臨床研究來確證BRV的臨床優(yōu)勢。

       參考文獻(xiàn)

       Emilio Russo, Rita Citraro & Marco Mula (2017) The preclinical discovery and development of brivaracetam for the treatment of focal epilepsy, Expert Opinion on Drug Discovery, 12:11, 1169-1178, DOI: 10.1080/17460441.2017.1366985